五、CYP1B1基因與青光眼
迄今為止人們通過典型家系的連鎖分析,共找到三個與原發(fā)性先天性青光眼相關的基因位點(GLC3A 、GLC3B、GLC3C),其中已經(jīng)確認CYP1B1是位于GLC3A位點上的致病基因,而在其他兩個位點上仍未找到致病基因。最近,Ali等和Narooie-Nejad等報道LTBP2(Gene encoding latent transforming growth factor beta binding protein 2)的基因突變可導致原發(fā)性嬰幼兒型青光眼(PCG),該基因與GLC3C位點僅間隔1.3 Mb。
(一)CYP1B1基因的發(fā)現(xiàn)和定位
細胞色素P4501Bl(Cytochrome P4501B1,CYP1B1)是CYP超家族中家族1亞家族B的惟一多肽,是一種亞鐵血紅素一硫醇鹽單加氧酶,主要位于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和外周膜結(jié)構(gòu)內(nèi)。
1995年,Sarfarazi等用連鎖分析從17個土耳其家系中得到第一個先天性青光眼基因位點GLC3A,定位于2p21,D2S1788/D2S1325與D2S1356之間的染色體區(qū)域,其中11個家系符合該位點。隨后Plásilová等又在7個吉普賽人PCG家系中證實了該位點。1997年Stoilov等基于當時的STSs和ESTs數(shù)據(jù),聯(lián)合應用STRs分子標記、YAC克隆篩選及放射性雜交等技術,首先確定SPTBN1、hSOS1、PRKR、CYP1B1、SFRS7為GLC3A的候選基因,然后通過直接測序、尋找與表型共分離的突變位點,最終確定CYP1B1為PCG的致病基因。
(二)CYP1B1基因的結(jié)構(gòu)和表達
CYP1B1基因定位于2p21~22,全長8547 bp,由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成(OMIM 601771)。其轉(zhuǎn)錄子長度為5.1 kb,編碼區(qū)始于第二外顯子,編碼蛋白含543個氨基酸,是一種膜結(jié)合蛋白。CYPIB1蛋白C端半側(cè)具有細胞色素P450家族的保守核心結(jié)構(gòu),包括四個螺旋束、螺旋J、K、兩個β折疊片層、血紅素結(jié)合域以及緊鄰血紅素結(jié)合域的曲折區(qū)域。這些保守結(jié)構(gòu)元件認為是參與了和血紅素結(jié)合的重要功能。CYP1B1蛋白的N端為含有疏水氨基酸殘端的跨膜區(qū)域,緊鄰該區(qū)域的是富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)域(hinge region),該結(jié)構(gòu)域具有保持跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的曲折柔韌性的能力。
CYP1B1可在全身多種組織中表達,如腎、心、脾、腦、肺、肝、骨骼肌、胸腺、腎上腺、睪丸、卵巢、子宮、乳腺、胎盤、小腸、大腸、淋巴結(jié)及外周血白細胞等,說明其在人類相關器官的分化、發(fā)育及功能行使中具有重要作用。
人眼中CYP1B1 mRNA在虹膜和睫狀體中的水平相對高于角膜、視網(wǎng)膜色素上皮和視網(wǎng)膜。免疫組化分析提示CYP1B1蛋白表達在人胎兒和成人眼中小梁網(wǎng)是缺失的,但是在睫狀體非色素上皮細胞和視網(wǎng)膜中出現(xiàn)。不過也有證據(jù)表明,CYP1B1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在成年人的小梁網(wǎng)cDNA基因庫中能測到。在鼠和人眼中都有CYP1B1的保守表達,在眼各個組織中的表達不同,胎兒眼中表達高于成人,在眼的功能和發(fā)育過程中起作用。睫狀體上皮CYP1B1的改變會導致重要內(nèi)源性底物代謝的降低和缺失,從而引起發(fā)育缺陷。在青光眼患者中,睫狀體基因表達的突變可以直接導致眼內(nèi)壓的異常升高,或者中斷正常的小梁網(wǎng)發(fā)育過程從而間接地影響房水的流出。通過睫狀體衍生調(diào)節(jié)因子的代謝作用參與這些過程,從而影響IOP。CYP1B1可能是眼部發(fā)育相關的某種內(nèi)源性底物的重要代謝酶,如花生四烯酸類物質(zhì)經(jīng)CYP1B1催化后的代謝產(chǎn)物通過抑制眼前節(jié)上皮細胞Na+-K+-ATP酶的活性,從而調(diào)節(jié)角膜透明性和房水分泌。其組織特異性與眼前節(jié)的形態(tài)發(fā)育及功能形成密切相關,從而可能參與PCG的發(fā)生發(fā)展。
(三)CYP1B1基因的突變研究
CYP1B1 自發(fā)現(xiàn)之日起,在各人種人群先天性青光眼的篩查中不斷發(fā)現(xiàn)新的突變。與其他3個青光眼相關致病基因(MYOC、OPTN和WDR36)一樣,CYP1B1的突變率在具有家族史的患者中明顯高于散發(fā)病例。在家族性病例中,CYP1B1的突變率從100%(斯洛伐克吉普賽人)、92%(沙特**)到55.6%(巴西)。對于散發(fā)病例CYP1B1的突變率則從41.7%(巴西)、37.5%(印度)、34%(摩洛哥)、33.3%(印度尼西亞)、22.3%(歐洲)到20%(日本)。
CYP1B1絕大多數(shù)的致病突變?yōu)榧兒贤蛔兓驈秃想s合突變,偶爾也有報道單純雜合突變發(fā)病者。據(jù)統(tǒng)計CYP1B1的突變共有82個(表2)。
表2列出了從PCG、PA、RA和POAG患者中發(fā)現(xiàn)的82個變異。包括46個錯義突變、10個無義突變、16個缺失、8個插入和(或)重復和2個同義突變。大約1/3的突變是基因插入或者缺失造成的,說明CYP1B1對于復合事件有較高的易感性。在POAG,PA和RA患者中CYP1B1突變比最初想象的具有更寬范圍的臨床表型。在PCG中,通過遺傳連鎖分析和突變掃描,CYP1B1最初被定位于GLC3A上。研究表示:CYP1B1是Peters′異常的一個致病因素,在這些患者中有4個位點的突變(Trp57stop、Met1Thr、Pro118Thr和Arg368His)和一個缺失(g.7889~7910缺失,R355~A358缺失)。另有證據(jù)表明,CYP1B1在病理生理學機制上和PCG以及其他的眼前節(jié)發(fā)育不良是相同的。
研究發(fā)現(xiàn),Rieger′s 異常中存在CYP1B1基因的突變(Trp57stop、g.4832~4834缺失、g.4838~4840缺失和g.8037~8046重復)。在PCG和POAG分離的特定家系中,這兩種形式的青光眼可能具有相同或重疊的CYP1B1介導的病理生理學機制。有研究揭示,在同一個家系中PCG和POAG的變異共存。此外,CYP1B1和MYOC變異的二基因遺傳導致的表型出現(xiàn)在更多報道中,提示CYP1B1可能是MYOC基因的修飾因子。但是,236個無關的法國高加索人POAG患者中的11個有CYP1B1的突變但MYOC基因沒有突變。這些個體為青年或者中年發(fā)病,發(fā)病時間顯著早于那些沒有攜帶CYP1B1突變基因的患者。除了一個無義突變,所有的這些突變都可以在PCG病例中檢測到。對印度人群的研究發(fā)現(xiàn),200個POAG患者中的9個患者具有6個CYP1B1的突變。在這些突變中,其中1個是新發(fā)現(xiàn)的純合突變(Arg523Thr),3個是以前在PCG患者中報道過的(Trp57Cys、Glu229Lys和Arg368His),2個是新發(fā)現(xiàn)的雜合突變(Ser515Leu和Asp530Gly)。
在一個青少年發(fā)病的POAG家系中(缺少MYOC或OPTN突變)檢測到了Arg523Thr,這個位點與疾病共分離,是一種常染色體隱性遺傳方式。在這個研究中檢測到了在CYP1B1區(qū)域中所有新發(fā)現(xiàn)的突變(Arg523Thr、Ser515Leu和Asp530Gly),沒有包含PCG或其他眼前節(jié)發(fā)育不良中的錯義突變。Chen等在一個中國發(fā)育型青光眼家系中發(fā)現(xiàn),兩個CYP1B1的SNPs (Arg48Gly和372-12 C>T)在所有的患者中都被檢測到,可能與MYOC基因的雜合突變Pro370Leu一起,對該家系的發(fā)育型青光眼共同作用。這些研究都提示CYP1B1在PCG和其他眼前節(jié)發(fā)育不良中起的致病作用比最初想象的更為重要,修飾POAG的病理發(fā)生過程,或者在一些條件下直接就是導致JOAG的主要原因。
近兩年來,CYP1B1又有多個突變被發(fā)現(xiàn)與青光眼相關。Huang等在一例PCG患者上發(fā)現(xiàn)在CYP1B1基因的第二外顯子上有c.C319G、L107V兩個錯義突變,在其他的PCG患者上發(fā)現(xiàn)4個SNPs,分別為R48G、A119S、V432L和D449D 。
Paolera等對30例巴西的PCG患者進行CYP1B1的突變研究發(fā)現(xiàn),其中9例(30%)有CYP1B1基因的突變,包括有已報道的突變Q19X、P437L、A443G、g.4340delG、 g.7901_79013delG- AGTGCAGGCAGA、g.8182delG、 g.8214_8215delG和三個新突變,分別是4635delT、4523delC和L378Q,以及3793T->C、R48G、A119S、L432V、D449D和N453S 多態(tài)性改變。
Hilal等對90例摩洛哥的PCG患者以及100名正常對照組進行了CYP1B1和MYOC突變分析的研究。在43例PCG患者中發(fā)現(xiàn)有12種CYP1B1的突變,其中有3個新突變,分別是 p.R163C、p.C470Y和g.4330-4331delTG,伴隨有中度或嚴重的表型。同時發(fā)現(xiàn)有2個新的基因內(nèi)多態(tài)性。g.4339delG 突變頻率最高,在31個家系中均有發(fā)現(xiàn),其次是p.G61E。而其他突變,包括p.R163C、p.E173K、g.4330-4331delTG、p.E229K、p.R390S、p.R368H、p.R469W、p.C470Y和g.7901-7913del13bp則比較少。
最初研究表明,CYP1B1基因的突變呈現(xiàn)完全外顯,但Bejjani等[65]在沙特的病例篩選中發(fā)現(xiàn)CYP1B1基因的外顯率大約僅為73%,因此推測可能另外存在非連鎖于GLC3A的抑制基因。此后突變體功能的研究證實,并非所有的突變均導致蛋白功能的完全喪失,有些突變?nèi)钥僧a(chǎn)生具有部分功能的蛋白。
CYP1B1的突變大多位于富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和保守核心區(qū),從而影響到分子的正確折疊、與血紅素結(jié)合的能力、形成復合物的穩(wěn)定性、對底物的作用等。Panicker等比較了45 位攜帶CYP1B1基因突變的先天性青光眼患者的基因型和表型的關系,發(fā)現(xiàn)在所有的突變中移碼突變產(chǎn)生的表型最為嚴重,這可能是由于移碼造成CYP1B1 基因C端重要結(jié)構(gòu)域的全部丟失,產(chǎn)生無功能的蛋白所致。
CYP1B1的晶體結(jié)構(gòu)還沒有被探明,但是可以根據(jù)許多P450的保守序列來推測。這些相似的模型提示CYP1B1錯義突變會影響到P450酶高度保守和重要的功能區(qū)域。例如:與Trp57Cys、Gly61Glu、Gly365Trp、Pro379Leu、Arg390His、Glu387Lys、Pro437Leu和Arg469Trp有關的突變在鉸鏈或保守編碼蛋白區(qū)域會破裂。另一個研究提示Asp192Val、Ala330Phe、Val364Met和Arg444Gln的突變會導致CYP1B1蛋白有意義的結(jié)構(gòu)改變。研究表明,野生型和突變型結(jié)構(gòu)對應的8個PCG突變(Ala115Pro、Met132Arg、Gln144Pro、Pro193Leu、Glu229Lys、Ser239Arg、Arg368His和Gly466Asp)都可以發(fā)展為相應模型來進行研究。用這些模型來進行分子動力學模擬實驗從而研究重要功能區(qū)的定時演變和結(jié)構(gòu)性的時間平均值。研究表明,對那些表現(xiàn)為腦回鈣化,牛眼,早發(fā)性青光眼的SWS患者需進行CYP1B1的突變分析。因血管畸形引起的靜脈怒張以及增加的眼內(nèi)壓,均可能導致表型加重。這將有助于對病程的預后和治療,也可幫助對這些病例的廣泛咨詢[67]。
六、結(jié)語與展望
近年來,對POAG遺傳相關基因的研究很多,但仍存在很多問題:
(1)目前只發(fā)現(xiàn)與之相關的3個基因,且這3個相關基因在此病產(chǎn)生的機制尚不清楚;
(2)POAG遺傳基因存在地區(qū)差異性,研究所得基因缺乏全面性及針對性,不能代表普遍現(xiàn)象;
(3)OPTN是不是POAG的第二個致病基因還存在爭議。MYOC和OPTN 基因之間可能產(chǎn)生相互作用,但具體原因也未明確;
(4)基因打靶技術的應用需要有具體的致病基因,但致使POAG產(chǎn)生的基因多樣且十分復雜,每個患者突變基因不同,因此很難應用于臨床。相信隨著分子生物學的發(fā)展,對青光眼相關致病基因研究將會更加深入和清晰。
最近的結(jié)論已經(jīng)證實CYP1B1是PCG的致病基因,且作為POAG的修飾基因,但很少被認為是POAG和其他一些眼前節(jié)發(fā)育不良的致病基因。CYP1B1缺陷鼠顯示了眼房水循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的異常,相似于人類PCG的患者。CYP1B1在青光眼中的作用到底是什么?目前的假說是CYP1B1代謝了內(nèi)源性的底物來產(chǎn)生發(fā)育中需要的代謝產(chǎn)物,或者清除發(fā)育中關鍵的底物。CYP1B1可能參與類固醇、花生四烯酸、維生素A以及N-乙酰-5-氧基色胺的代謝。所有這些代謝通路都可能產(chǎn)生信號分子來參與青光眼和其他眼前節(jié)發(fā)育不良的發(fā)展和病理生理過程。但是問題的關鍵是哪一個通路是致病性的及重要的,也不排除還有另外一個CYP1B1介導的通路參與青光眼的可能。在青光眼患者中觀察到的CYP1B1等位基因異質(zhì)性支持了這一假說,同時也說明很可能CYP1B1不同突變導致酶活性水平發(fā)生變化或者甚至改變了底物的特性。這可能影響了CYP1B1介導的代謝過程,在不同個體中CYP1B1代謝產(chǎn)物的濃度和產(chǎn)生不同的表型。
目前關于PCG患者基因型(CYP1B1突變)-表型(房角發(fā)育不良的程度和疾病嚴重程度)的研究說明,特異性的CYP1B1的突變可能和房角異常嚴重程度有關,這些研究提供給青光眼專家分子學工具來診斷PCG。但是需要進一步研究青光眼和其他眼前節(jié)發(fā)育不良疾病中CYP1B1的確切作用。CYP1B1缺陷鼠提供了很好的實驗模型,可以研究野生型鼠和CYP1B1基因缺陷鼠的房水代謝過程來闡明CYP1B1代謝了內(nèi)源性的底物,從而在發(fā)育過程中產(chǎn)生或者消除對發(fā)育非常重要的底物。進一步利用蛋白組學方法對這些鼠類在不同發(fā)育階段眼前節(jié)的基因表達,可以揭示CYP1B1在青光眼中起到的病理作用。(青光眼分子遺傳學研究進展 蔡素萍,陳曉明,閆乃紅,劉旭陽)
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