三、OPTN基因與青光眼

    OPTN基因是除MYOC基因外第二個(gè)發(fā)現(xiàn)的與POAG有關(guān)的基因，現(xiàn)在認(rèn)為與NTG的發(fā)病關(guān)系密切。1998年Sarfarazi等確定了1個(gè)新的POAG致病基因位點(diǎn)GLCIE，位于10p14～p15。Rezaie等報(bào)道了GLC1E基因位點(diǎn)上的optineurin（optic neuropathy inducing，OPTN）基因突變可能導(dǎo)致正常眼壓性POAG，發(fā)現(xiàn)16.7%的遺傳性POAG患者可能伴有OPTN基因突變，并推測(cè)OPTN基因在視神經(jīng)損害過(guò)程中可能起到保護(hù)作用。

    （一）OPTN基因的發(fā)現(xiàn)和定位

    Sarfarazi等對(duì)一青光眼家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該家系與10號(hào)染色體短臂上的短串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記（short tandem repeat polymorphism，STRP）D10S1172存在連鎖。進(jìn)一步將GLCIE基因位點(diǎn)位于D10S1729和D10S1664之間的21 cm區(qū)域內(nèi)。經(jīng)進(jìn)一步分析，將候選基因的范圍縮小到5 cm 的范圍內(nèi)（包含5個(gè)候選基因），在排除了其他基因后確定OPTN基因?yàn)閷?dǎo)致POAG發(fā)病的致病基因之一。

    OPTN基因曾被稱為FIP2基因和NRP基因，2002年，經(jīng)人類基因組組織命名委員會(huì)批準(zhǔn)，Rezaie等將其命名為OPTN，其編碼的蛋白產(chǎn)物命名為optineurin 。

    （二）OPTN基因的克隆

    OPTN基因編碼的optineurin蛋白被作為是FIP2（14.7K-interacting protein）和NEMO相關(guān)蛋白（NRP），能與Huntingtin、Ras相關(guān)蛋白（RAB8）、轉(zhuǎn)錄因子ⅢA等相互作用。

    C組人腺病毒Ad的E3區(qū)（Early region 3）編碼多種TNF-α抑制子，特別是一種E3-14.7K蛋白（E3 14.7 kD）。Li等用E3-14.7K篩選HeLa細(xì)胞cDNA文庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種包含多個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的新蛋白，命名為14.7k-interacting protein，即FIP2。Schwamborn等發(fā)現(xiàn)了一種與NEMO蛋白（NF-κB  essential modulator）高度同源的蛋白，命名為NRP（NEMO-related protein）。此蛋白有53%與NEMO同源。研究還證實(shí)NRP的表達(dá)可被干擾素和TNF-α誘導(dǎo)。并在這兩種因素的刺激下NRP的表達(dá)呈明顯上調(diào)反應(yīng)。

    （三）OPTN基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)

    OPTN基因共有16個(gè)外顯子組成，其中包括13個(gè)編碼外顯子和3個(gè)位于5′-UTR（5′ untranslated region）的非翻譯外顯子。其開放閱讀框共有1734 bp，共編碼577個(gè)氨基酸蛋白（66 kD）。OPTN基因的5′端共有3種不同的同族異構(gòu)結(jié)合區(qū)，Genebank序列號(hào)分別為AF42037l、AF420372和AF420373，但它們都有相同的開放閱讀框。已證實(shí)鼠的OPTN基因與人類的OPTN基因78% 同源，共編碼584個(gè)氨基酸。OPTN基因結(jié)構(gòu)中有3個(gè)已知的重要的功能域：位于4、5外顯子的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)；10、11外顯子的亮氨酸拉鏈和位于optineurin蛋白羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)。

    研究證實(shí)OPTN基因廣泛表達(dá)于人體各種組織和器官之中。已發(fā)現(xiàn)OPTN基因在人類的心臟、腦、胎盤、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺中表達(dá)，在人類的小梁網(wǎng)、非色素睫狀上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜、腎上腺皮質(zhì)、淋巴細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中也有表達(dá)。optineurin蛋白富集于高爾基體，出現(xiàn)在不同種屬的房水中，如人、獼猴、牛、豬、山羊、綿羊、貓、兔等，認(rèn)為optineurin蛋白是一種分泌蛋白。

    （四）OPTN基因的突變研究

    目前已有許多OPTN基因突變的報(bào)道。2002年，Rezaie等在54個(gè)成年型POAG（多為NTG）家系中，通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single stranded conformation polymorphism，SSCP）分析OPTN基因突變，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)突變，分別為Glu50Lys、Premature stop（691-692插入AG）、Arg545Gln和Met98Lys。并將Glu50Lys、Premature stop、Arg545Gln確定為青光眼致病性基因突變，Met98Lys確定為青光眼的高危多態(tài)性改變。Glu50Lys發(fā)生在堿性亮氨酸拉鏈（basicleucinezipper，bZIP）基序，bZIP基序與DNA的結(jié)合和蛋白的二聚作用有關(guān)；Premature stop使終止信號(hào)提前出現(xiàn)，OPTN蛋白縮短76%，從而引起其功能喪失；Arg545Gln的突變雖然不在蛋白區(qū)，但它鄰近與轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)的鋅指基序。Met98Lys在bZIP區(qū)，推測(cè)它為顯性可疑突變。在這些家系中，16.7%存在OPTN基因突變，13.5%發(fā)現(xiàn)Glu50Lys突變，Arg545Gln突變存在于2.2%的家系中。在患者及正常對(duì)照者中均發(fā)現(xiàn)Met98Lys突變，分別為13.6%和2.1%。

    Tang等對(duì)日本165例POAG患者、148例NTG與196位正常人比較，發(fā)現(xiàn)在日本人中OPTN基因有12種單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），未發(fā)現(xiàn)上述的OPTN基因突變，提示OPTN基因突變存在著種族差異性。Leung等分析了119例散發(fā)的中國(guó)POAG患者與126位正常人，發(fā)現(xiàn)了OPTN基因16種序列改變（外顯子突變9種，內(nèi)含子突變7種），其中3種為已報(bào)道的突變：Thr34Thr、Met98Lys和Arg545Gln,13種是新發(fā)現(xiàn)的突變，包括：Thr49Thr、Glu103Asp、Val148Val、Pro199Pro、Thr202Thr、His486Arg、IVS6-5T>C、IVS6-10G>A、IVS7＋24G>A、IVS8＋20G>A、IVS13＋21C>G、IVS15＋10G>A和IVS15-48C>A。其中Glu103Asp、Val148Val、His486Arg、IVS13＋21C>G僅在POAG患者中發(fā)現(xiàn)，Pro199Pro、Thr202Thr、IVS8＋20G>A僅在正常人中發(fā)現(xiàn)。IVS7＋24G>A與POAG有顯著關(guān)聯(lián)，雖然IVS7＋24G>A是非編碼序列改變，但有可能影響mRNA的穩(wěn)定性，從而影響OPTN蛋白的功能。

    Wiggs等則認(rèn)為OPTN基因突變與成人POAG無(wú)關(guān)。對(duì)86例成人POAG和80位正常人進(jìn)行OPTN基因突變分析，發(fā)現(xiàn)Met98Lys在9例（10.5%）POAG患者中發(fā)生了突變，而正常人中有10%的個(gè)體發(fā)生了突變，說(shuō)明與NTG有關(guān)的OPTN基因突變與POAG無(wú)關(guān)，NTG不是POAG的特殊表現(xiàn)型。其他研究表明，在JOAG患者中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Met98Lys突變頻率增加。同義突變和非編碼區(qū)突變不導(dǎo)致密碼子改變，但可影響mRNA的穩(wěn)定性和蛋白功能。位于OPTN基因的Thr34Thr序列改變屬同義突變，與POAG有明顯相關(guān)性。姚紅艷等在我國(guó)**的患病人群中檢測(cè)到與Rezaie等在高加索人群中不同的OPTN 基因突變（Ile407Thr），沒(méi)發(fā)現(xiàn)其他人種中常見的Leu41Leu、Glu50Lys和Arg336Gly。

    OPTN基因的突變研究以及其與POAG的關(guān)系目前存在較大爭(zhēng)議，許多遺傳學(xué)家針對(duì)不同種族和不同家系的研究得出不同的結(jié)果。Fan等首先報(bào)道MYOC、OPTN和APOE之間可能存在基因-基因相互作用，Park等[46]報(bào)道OPTN基因的高表達(dá)可以誘導(dǎo)MYOC基因的過(guò)度表達(dá)，這些研究為POAG的多基因致病機(jī)制假說(shuō)提供了具體實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    （五）OPTN基因在POAG發(fā)病中的作用

    OPTN基因是第二個(gè)被確認(rèn)為與POAG 有關(guān)的基因。optineurin蛋白的功能以及與青光眼發(fā)生的病理機(jī)制還不清楚。研究表明，無(wú)論在體外的GST蛋白黏附測(cè)驗(yàn)，還是在體內(nèi)的免疫沉淀試驗(yàn)都能觀察到FIP2與E3-14.7K 蛋白相互作用。FIP2能引起E3-14.7K重新分布到細(xì)胞核的周圍。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)FIP2的表達(dá)能被TNF-α誘導(dǎo)，并表現(xiàn)出時(shí)間依賴的方式。推測(cè)FIP2可能是TNF-α信號(hào)途徑中一個(gè)重要的組成部分。

    體外培養(yǎng)小梁細(xì)胞在地塞米松、模擬高眼壓環(huán)境、TNF-α刺激條件下，OPTN基因表達(dá)明顯增高，證實(shí)optineurin蛋白可能與視神經(jīng)及小梁網(wǎng)保護(hù)以及維持眼壓有關(guān)。optineurin蛋白可與多種蛋白相互作用形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的交通和細(xì)胞形態(tài)的形成。Rezaie等認(rèn)為野生型optineurin蛋白通過(guò)TNF-α的信息傳導(dǎo)通路發(fā)揮保護(hù)視神經(jīng)的作用，在青光眼患者中，突變的optineurin蛋白正常保護(hù)作用消失，引起視力下降、視野缺損等一系列改變。Kamphuis等的報(bào)道則相反，認(rèn)為optineurin蛋白在人小梁網(wǎng)的表達(dá)不隨眼壓升高而改變。在人眼的灌注模型中，24 h內(nèi)灌注壓從10 mm Hg升高到30 mm Hg，optineurin蛋白在小梁網(wǎng)的表達(dá)不隨灌注壓的升高而改變，故認(rèn)為optineurin蛋白不參與眼壓升高時(shí)的房水引流機(jī)制。其他研究發(fā)現(xiàn)，OPTN基因在細(xì)胞胞吐作用和高爾基體形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能與fas-配體介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。

    optineurin蛋白為分泌型蛋白，其突變后optineurin蛋白的減少可能導(dǎo)致青光眼性視野缺損和視神經(jīng)病變，也可能造成optineurin蛋白結(jié)構(gòu)的變化而改變?cè)摶虻墓δ?，從而使其拮抗凋亡的作用喪失，產(chǎn)生青光眼病理?yè)p害。

    四、WDR36基因與青光眼

    WDR36（WD repeat domain 36）是近年才發(fā)現(xiàn)的與POAG相關(guān)的新基因，位于GLC1G。

    （一）WDR36 基因的發(fā)現(xiàn)和定位

    2005年，Monemi等對(duì)POAG家系進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果顯示連鎖范圍位于5q21.3與5q31.3 （D5S1466～D5S1480）之間，將POAG致病基因定位在GLC1G關(guān)鍵區(qū)域，大約位于5q21.3 與5q22.1 （D5S1466～D5S2051）約2 Mb的區(qū)域之間。通過(guò)在GLC關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)對(duì)7個(gè)候選基因進(jìn)行突變篩選，排除了其他6個(gè)基因后最終確定WDR36為一個(gè)新的POAG致病基因。

    （二）WDR36基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)

    WDR36基因含有23個(gè)外顯子，編碼一個(gè)951個(gè)氨基酸的蛋白。其結(jié)構(gòu)至少有下列幾個(gè)模序組成：（1）G-βWD40重復(fù)序列（guanine nucleotide binding protein-beta WD40 repeat）結(jié)構(gòu)域；（2）Utp21 特異性WD40 聯(lián)合假定結(jié)構(gòu)域（Utp21-specificWD40 associated putative domain）；（3）細(xì)胞色素cd1-亞硝酸鹽還原酶樣（cytochrome cd1-nitrite reductase-like，C-terminal heme d1）結(jié)構(gòu)域。該蛋白屬于編碼WD 重復(fù)蛋白家族的成員之一，該家族在細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡以及基因調(diào)控中起一定作用。Northern印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在人類的心臟、胎盤、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺中含有5.9 kb和2.5 kb兩種不同形式的mRNA 轉(zhuǎn)錄體。逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)顯示，WDR36在人類的晶狀體、虹膜、鞏膜、睫狀肌、睫狀體、小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)均有表達(dá)。

    （三）WDR36基因的突變研究

    在Monemi等[48]的研究中，對(duì)130例POAG病例進(jìn)行了WDR36全部基因組DNA的突變分析，共發(fā)現(xiàn)24個(gè)DNA序列改變。其中4個(gè)突變（Asn355Ser、Ala449Thr、Arg529Gln和Asp658Gly）發(fā)現(xiàn)于17個(gè)散發(fā)POAG患者，包括11個(gè)高眼壓型青光眼（high tension glucoma，HTG）和6個(gè)NTG。同時(shí)WDR36基因的這4個(gè)突變?cè)谌祟?、黑猩猩、狗、大鼠和小鼠的物種中是保守的。Kramer等[50]對(duì)一大家系進(jìn)行了WDR36所有外顯子的突變分析，發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)序列改變與Monemi等報(bào)道的一致，且在正常人群中也存在，因而均不是致病因素。由于僅檢測(cè)外顯子區(qū)域，可能新的和已知的SNP存在于該家系的供體和受體剪切位點(diǎn)，因此很可能改變WDR36基因的剪切方式。WDR36基因啟動(dòng)子區(qū)域的突變也可能是該P(yáng)OAG家系的致病原因。另外，該家系的青光眼發(fā)生，可能是由于該區(qū)域（ 5q21.2和5q22.1之間）中其他基因的改變所致。

    有研究者分析了一組美國(guó)HTG患者的WDR36序列改變情況，發(fā)現(xiàn)了32個(gè)WDR36序列改變（包括先前報(bào)道的“致病”和“可疑”改變），在POAG患者和正常對(duì)照組中的改變率分別為17%和4%。該研究得出，盡管WDR36改變與疾病分布無(wú)一致性，但在相對(duì)嚴(yán)重的患者中序列改變更為多見。Weisschuh等[51]對(duì)112例德國(guó)NTG患者進(jìn)行了WDR36基因突變檢測(cè)，其中Ala449Thr、Arg529Gln和Asp658Gly為已報(bào)道的致病突變，新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)致病突變Pro31Thr，另外還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)同義突變（Gln197Gln、Lys564Lys、Val714Val和Val 727Val）和11個(gè)內(nèi)含子多態(tài)性改變，該研究提示在德國(guó)人群中WDR36的序列改變可能只存在于NTG的少數(shù)病例中。

    Miyazawa等對(duì)日本136例HTG患者和103例NTG患者的研究共發(fā)現(xiàn)了20個(gè)序列改變，其中10個(gè)改變（Ile264Val、1494＋90C>T、1494＋143A>G、1609＋89G>A、1775＋89C>A、1965-30A>G、Val714Val、2170＋217C>T、Val727Val和2518＋60G>C）是已報(bào)道的。

    另外10個(gè)（Asp179Asp、Gln270Gln、Met283Arg、898＋63C>G、1074＋20C>T、Gly459Gly、1884＋26C>G、Ser664Leu、Ser664Ser和Pro744Pro）是在該人群中新發(fā)現(xiàn)的。其中錯(cuò)義突變Ile264Val是一個(gè)普遍存在的序列改變，在HTG先證者和正常對(duì)照中均有發(fā)現(xiàn)。與正常對(duì)照組相比，Ile264Val錯(cuò)義突變頻率在HTG患者中更高，而在NTG患者中卻沒(méi)有明顯不同，提示W(wǎng)DR36基因突變可能與HTG的發(fā)病相關(guān)。Fan等對(duì)來(lái)自**漢族人群的82例HTG患者、42例NTG患者、11例JOAG患者和77位正常對(duì)照的研究，發(fā)現(xiàn)了19個(gè)WDR36序列改變，其中8個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的改變，包括2個(gè)錯(cuò)義突變（Leu240Val和Ile713Val）。其中3個(gè)HTG患者攜帶了新發(fā)現(xiàn)的致病性突變Ile713Val，表明WDR36基因在中國(guó)HTG患者中的突變率為3.7%。但該研究發(fā)現(xiàn)WDR36基因似乎與中國(guó)人的NTG和JOAG發(fā)病無(wú)關(guān)。

    另一方面，Hewitt等在249例POAG患者和217例正常對(duì)照中檢測(cè)已報(bào)道的突變Asp658Gly，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在POAG和正常對(duì)照組中的改變率分別為1.6%和1.8%，因此認(rèn)為Asp658Gly是一個(gè)中性序列改變。確定WDR36為青光眼的致病基因尚需更多的研究證據(jù)。

    （四）WDR36基因在POAG發(fā)病中的作用

    WDR36是WD40重復(fù)蛋白家族成員，WD重復(fù)蛋白家族中的成員參與細(xì)胞形成的各個(gè)過(guò)程，包括細(xì)胞周期的進(jìn)展、轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡及基因調(diào)節(jié)。其功能以及在正常眼壓性青光眼中的作用尚不清楚，但WDR36已經(jīng)被證實(shí)參與T細(xì)胞的活化過(guò)程。研究提示某些青光眼患者可能發(fā)生依賴IL22的細(xì)胞免疫性改變。有假說(shuō)提出，在人和小鼠青光眼模型中，T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)參與青光眼相關(guān)的視神經(jīng)退行性改變。為了更深入地了解WDR36在青光眼發(fā)生中所起的作用，有必要了解IL22對(duì)它的調(diào)控作用以及它與T細(xì)胞活性的關(guān)系。目前研究證明WDR36與POAG的形成與發(fā)展有關(guān)，關(guān)于WDR36基因突變與POAG發(fā)病關(guān)系的研究較少，而且不同的研究有不同的結(jié)果。WDR36基因所編碼蛋白的功能及其在POAG發(fā)病中的作用目前尚不清楚。