文獻標題：RIOK3-Mediated Phosphorylation of MDA5 Interferes with Its Assembly and Attenuates the Innate Immune Response.

    文獻來源：Cell Rep 2015 Apr 7

    天然免疫應(yīng)答對于抵抗病毒的感染十分重要。RIG-I與MDA-5是最常見的細胞內(nèi)部識別病毒RNA的信號分子，它們的識別與激活能夠傳遞胞內(nèi)的抗病毒免疫反應(yīng)。MDA-5能夠識別較長的雙鏈RNA分子，而RIG-I識別的序列長度較短。

    對于MDA-5來講，它由N端的兩個C**結(jié)構(gòu)域，中部的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域以及C端的一個結(jié)構(gòu)域（CTD）構(gòu)成，其中CTD負責(zé)識別胞內(nèi)的雙鏈病毒RNA分子。隨后，MDA-5圍繞RNA分子通過蛋白-蛋白相互作用彼此頭尾相連，最終形成纖維狀的結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)能夠促進C**的寡聚化，而寡聚化后的C**復(fù)合體則能夠進一步結(jié)合位于線粒體上的MAVS蛋白進行信號的傳遞。以前的研究顯示MDA5的活性受到其C**的磷酸化調(diào)控，然而內(nèi)在的分子機制卻仍不清楚，同時C端的功能也同樣不清楚。

    最近，來自北海道大學(xué)的Tsukasa Seya課題組在《cell report》雜志上發(fā)表了他們對MDA-5 C端磷酸化的分子機制以及其作用的相關(guān)研究。

    首先，作者通過體外的生化實驗證明MDA-5存在磷酸化形式。他們發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中過表達的FLAG-MDA-5在SDS-PAGE中移動速度較慢，而在加入磷酸酶CLAP后該蛋白的遷移速度明顯加快。之后的突變分析證明該磷酸化存在于MDA-5的C-端。

    為了找到作用于MDA-5的蛋白激酶，作者進行了酵母雙雜交實驗。實驗結(jié)果顯示：RIOK3與MDA-5 C-端存在相互作用，后續(xù)的免疫共沉淀實驗證明了這一結(jié)論。另外，作者還通過共聚焦顯微成像的手段證明了MDA-5與RIOK3存在共定位，而且它們不論在**前后均位于胞漿中，而遠離線粒體。之后，作者通過RNAi的手段人為降低了RIOK3的水平，結(jié)果MDA-5的磷酸化程度明顯上升。這一結(jié)果說明RIOK3參與了MDA-5的磷酸化。

    接下來，作者希望了解RIOK3對MDA-5的磷酸化對于這一信號究竟有什么影響。通過在HEK293中過表達MDA-5與RIOK3,作者發(fā)現(xiàn)RIOK3的存在能夠明顯抑制MDA-5過表達帶來的免疫信號增強，然而，MAVS過表達產(chǎn)生的免疫信號并不能被RIOK3所抑制，這說明RIOK3的作用產(chǎn)生在MAVS的上游。另外，作者通過RNAi人為下調(diào)HEK293細胞中RIOK3的表達量以及使用RIOK3敲除的HEK293細胞進行實驗也得到了相同的結(jié)論。

    之后，作者利用突變分析的手段證明了RIOK3特異性磷酸化MDA-5在828位的絲氨酸。另外，作者還通過生化實驗證明了RIOK3對MDA-5的磷酸化抑制了其在激活條件下形成多聚體的活性。綜上，通過一系列生化試驗，作者證明了一個新的抗病毒免疫調(diào)控機制。